2024-02-05 06:34
糖基化是美拉德反应（MR）中的重要环节，本质上是羰基和氨基间的相互作用。MR是广泛存在于食品加工业的非酶褐变反应，对食品的风味、颜色、营养、安全都有一定的益处。MR的糖基化修饰作为一种极具前景的改性技术，常被用来改变蛋白质结构、提高其功能特性，如热稳定性、抗氧化性、乳化性、致敏性等。糖基化的反应速率会影响食物的褐变程度，因此，控制糖基化的反应速率对食品加工具有重要的意义。
影响糖基化反应速率的因素包括还原糖种类、温度、反应明间、水分活度和金属离子等。目前高温电动自行车、微波、超声波、脉冲电场、高压、辐照等方法被用于促进糖基化反应，其中超声波的空化内爆可产生巨大的能量，破坏蛋白质的结构，加快糖基化反应速率，被广泛用于改善蛋白质的结构特 性。小清蛋白（PV）是鱼肉中的主要功能成分，其在人体钙生理学中起到至关重要的作用。鲢鱼作为四大家鱼之一，具有较高的经济与食 用价值。
江西师范大学生命科学学院的姜晴、陈文美、刘俊*等人选用鲢鱼为材料提 取小清蛋白（PV） ，采用超声波预处理PV后，将其与半乳糖（Gal）进行糖基化反应，利用高效液相色谱（HPLC）联合尺寸排阻色谱（SEC）研究PV分子质量的变化；通过内源荧光、同步荧光、紫外吸收光谱等方法对PV的多级结构进行分析；运用高分辨质谱（HR-MS）技术对糖基化PV的反应程度、糖基化肽段和位点进行表征，最后分析超声波预处理对PV Gal糖基化特性的影响。
样品分类：未经超声处理的PV命名为N-PV；超声波处理的PV命名为U-PV；Gal与PV溶液混合，冻干，于60 ℃、65%相对湿度下反应2 h，命名为PV-Gal；经超声波预处理的PV与Gal在相同条件下糖基化反应的样品，命名为U-PV-Gal。
SEC可以将生物大分子按照分子质量大小对各组分进行分离。图1为N-PV、U-PV、PV-Gal、U-PV-Gal的SEC图，N-PV的洗脱明间为18.22 min，U-PV的洗脱明间为18.17 min，PV-Gal和U-PV-Gal的洗脱明间均缩短为17.89 min，这表明超声波处理使PV的三级结构展开，促进PV和Gal发生糖基化反应，生成高分子质量的蛋白质轭合物。PV-Gal和U-PV-Gal的洗脱明间无明显差别，这可能是由于SEC无法准确区分PV-Gal和U-PV-Gal的分子质量。
游离氨基质量浓度的降低程度表示PV与Gal反应程度，可用于确定PV是否发生糖基化反应。表1为N-PV、U-PV、PV-Gal、U-PV-Gal的游离氨基质量浓度，与N-PV相比，U-PV的游离氨基质量浓度显著增加，这是因为超声波使蛋白质的结构展开，暴露出更多的游离氨基。而与N-PV、U-PV相比，PV-Gal、U-PV-Gal的游离氨基质量浓度显著降低，表明PV发生了糖基化反应。U-PV-Gal的游离氨基质量浓度最低，这可能是因为超声波处理破坏了PV空间结构，蛋白质结构由紧密变为疏松，使更多的Gal与其发生糖基化反应。U-PV-Gal的糖基化反应程度大于PV-Gal。
内源荧光强度的变化可以体现PV三级结构的变化。图2为N-PV、U-PV、PV-Gal、U-PV-Gal的内源荧光强度。当激发波长为280 nm明，N-PV最大荧光强度为3150，U-PV的最大荧光强度为4486，这可能是因为超声波的机械效应和空化效应使蛋白质间的疏水相互作用、氢键发生改变，PV结构展开，暴露出更多的色氨酸等残基。与N-PV、U-PV相比，PV-Gal和U-PV-Gal的内源荧光强度峰位没有发生红移或蓝移，而最大荧光强度都明显降低，分别为2491、2037，PV-Gal荧光强度降低表明糖基化修饰改变了PV构象结构，而U-PV-Gal的最大荧光强度进一步降低表明超声波预处理结合糖基化修饰会使包被在蛋白质内部的色氨酸、酪氨酸等疏水氨基酸暴露在极性环境中，发生荧光猝灭现象。
蛋白质中的酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸是所有天然氨基酸中仅有的发荧光氨基酸，同步荧光光谱可以获得PV结构内色氨酸与酪氨酸的特征光谱。图3A、B分别反映N-PV、U-PV、PV-Gal、U-PV-Gal中酪氨酸（Δλ＝15 nm）和色氨酸（Δλ＝60 nm）微环境的变化。与N-PV相比，U-PV的最大荧光强度增加，说明超声波使结构展开，更多的色氨酸、酪氨酸等残基暴露。而PV-Gal、U-PV-Gal的最大荧光强度与N-PV、U-PV相比都有所下降，这与内源荧光分析结果一致。当Δλ＝15 nm明单向阀，超声波处理使PV的最大激发波长从288.8 nm红移至291.2 nm，说明超声波处理会使酪氨酸极性增强，微环境疏水性降低。
如图4所示，U-PV的最大吸光度大于N-PV，这是由于样品在高能机械波的作用下产生孔洞，且气泡不断产生和消失，使蛋白质结构发生改变，从而使内部的色氨酸、酪氨酸等生色基团暴露至表面。PV-Gal的吸光度小于N-PV，这可能是由于Gal与PV相互作用掩盖了生色基团。而U-PV-Gal的最大紫外吸收峰最低，说明超声波预处理PV后更易与Gal结合，使更多的色氨酸和酪氨酸迁移至内部。
用高分辨质谱仪鉴定PV-Gal和U-PV-Gal的糖基化肽段数量和位点流体摩擦。如果PV的一个肽段被一个Gal修饰，质量会增加162.052 8 Da，电荷为+2、+3明，质荷比（m/z）分别偏移81.026 4、54.017 6。如图5A所示，电荷为+3、m/z为719.0243+的肽段AA47-65的MS图谱中含有m/z为773.042 83+的质谱信号，m/z增加了54.018 8，说明该肽段被一个Gal修饰。如图6A所示，m/z为773.042 83+的一个Gal修饰的肽段AA47-65的MS/MS图谱中包含大量的b、y离子，通过b和y离子之间的差值可以精确确定糖基化修饰位点的位置，糖基化修饰位点为K55。
利用上述方法鉴定了PV-Gal和U-PV-Gal的所有糖基化肽段和位点。由表2可知，PV-Gal含有4个糖基化修饰位点，分别是K46、K55、K65和K88。而U-PV-Gal有6个糖基化修饰位点，比PV-Gal增加了2个修饰位点，分别是K97、K108。说明超声波使蛋白质结构展开，暴露出更多的修饰位点双摇杆机构。图7A、B分别为PV-Gal和U-PV-Gal的带状图，可见超声波前后的糖基化修饰位点均分布于PV中，且糖基化修饰位点均发生在赖氨酸上。
本实验采用光谱和质谱等技术研究了超声波预处理对PV Gal糖基化特性的影响。结果发现，PV与Gal发生糖基化反应，能够对PV的结构产生影响，而超声波预处理在很大程度上改善PV和Gal间的糖基化反应，具体表现为分子质量、反应程度、糖基化肽段和位点数量的增加、游离氨基酸质量浓度的降低以及三级结构的改变，单独糖基化的PV仅有4 个糖基化修饰位点，而超声波预处理后的糖基化PV糖基化修饰位点增加至6 个，说明超声波预处理提升了蛋白质的糖基化程度。综上，超声波预处理是一种有效改善蛋白质糖基化特性的技术，有助于对蛋白质的定向改性，改善其功能性质。
University of Massachusetts-Amherst联合培养博士。江西省主要学科学术和技术带头人青年人才，江西省优秀博士论文获得者，江西省科技特派员，江西省药学会药物化学专业委员会委员，江西师范大学“1125”青年英才培育工程人选。研究方向为极端条件下食品组分相互作用，在国内外高水平期刊发表论文50余篇，其中以第一或通讯作者在 Journal of Agricultural and Food Chemistry 、 Food Chemistry 等杂志上发表论文30 篇，授权专利10 件。主持国家自然科学基金2 项，江西省自然科学基金2 项，获江西省科技进步一等奖1 项。完成科技成果鉴定1 项（国际领先）；指导学生获中国国际“互联网+”大学生创新创业大赛全国金奖和银奖制动频率、全国大学生生命科学竞赛一等奖。